Ny metod tar analys av genetiska bibliotek till nya nivåer

Uppsalaforskare har utvecklat en ny metod för att undersöka dynamiska förlopp i stora genetiska bibliotek. Genom att applicera metoden på cellcykelreglering kan de bidra de till en tydligare bild av den gäckande kontrollmekanismen. Studien är publicerad i tidskriften Nature Methods.

Modern genteknologi gör det möjligt att snabbt och billigt introducera tusentals olika DNA-förändringar i mänskliga celler eller i bakterier för att på så vis skapa bibliotek av genetiskt olika celler. CRISPR/cas9-systemet, eller ”gensaxen” som den också kallas, kan modifieras och användas för att justera uttrycket av tusentals olika proteiner. Genom att förse varje modifikation med en genetisk streckkod, kan man hålla reda på vilken cell som bär på vilken förändring.

Samtidigt har utvecklingen inom optik och bildanalys gjort det möjligt att undersöka de kemiska processerna inuti cellen med oerhört hög precision. I princip är det möjligt att ”filma” grundläggande biologiska förlopp som proteinuttryck eller celldelning inuti en levande cell på molekylnivå.

Tänk dig nu att det vore möjligt att kombinera de avancerade optiska metoderna med storskalig genteknik. Om vi är intresserade av en viss biologisk process skulle vi i teorin kunna identifiera samtliga inblandade gener genom att observera den biologiska processen i ett genetiskt bibliotek. Studier som hittills tagit flera år i anspråk skulle kunna genomföras i ett enda experiment – i teorin.

De utmaningar som hittills hindrat forskare från att omsätta teorin i praktiken har i stort sett varit tekniska. Hur gör man för att hålla reda på tusentals olika celler så att man först kan undersöka deras biologi och sedan läsa av den genetiska streckkoden?

En grupp Uppsalaforskare tog sig an utmaningen och presenterar nu metoden ”DuMPLING” (Dynamic u-fluidic Microscopy-based Phenotyping of aLibrary before IN situ Genotyping) som gör det möjligt att undersöka hela biblioteket av levande celler i ett enda mikroflödeschip.

– Metoden är oerhört kraftfull och gör att vi kan länka genetisk information till komplexa cellbeteenden på en helt ny nivå, säger Johan Elf, professor i molekylär systembiologi vid Uppsala universitet, som leder studien.

Johan och hans team är bland annat intresserade av vad som styr cellcykeln i bakterier. I alla celler, även mänskliga, är det livsviktigt att allt DNA kopieras exakt en gång innan varje celldelning, annars riskerar cellen att förlora genetiskt material, alternativt att ackumulera DNA med lika förödande konsekvenser. Trots att cellcykelreglering har studerats i decennier är det fortfarande oklart hur cellerna åstadkommer den strikta kontroll som krävs.

– Vi kan ta fram modeller som fungerar, men eftersom vi inte ens känner till alla spelarna, är det väldigt svårt att avgöra om modellerna är biologiskt relevanta. Med hjälp av den nya metoden hoppas vi kunna fiska fram de okända komponenterna, säger Daniel Camsund, forskare i molekylär cellbiologi vid Uppsala universitet.

Forskarna skapade ett genetiskt bibliotek där de vridit ner uttrycket av olika kända cellcykelreglerare samt ett antal okända gener och använde sedan DuMPLING för att studera hur cellcykeln påverkades av dessa modifikationer. Och nu kommer det finurliga. När all cellcykeldata är insamlad, byts näringslösningen i chippet ut mot en vätska som fixerar cellerna och bevarar dem i sina positioner. Den genetiska streckkoden kan nu läsas av med hjälp av mikroskopi och färgkodade DNA-snuttar.

– Det är fascinerande att se hur färgkoden växer fram. Men lyckligtvis är det inte jag som sköter avkodningen. Vi har mjukvara som tar hand om den biten. Säger Jimmy Larsson forskare i molekylär cellbiologi vid Uppsala universitet.

Resultatet är uppmuntrande. Från den data som samlats in kan forskarna identifiera de flesta av de kända regulatoriska elementen, vilket betyder att metoden fungerar, men eftersom DuMPLING producerar tidsupplöst data kan man också säga på vilket sätt cellcykeln påverkats av de olika modifikationerna. Nästa steg är att utöka biblioteket till att omfatta samtliga gener i bakteriegenomet; förhoppningsvis kommer detta att innebära ett steg närmare en fullständig beskrivning av bakteriecellcykelns kontrollmekanism. 

Time-resolved imaging-based CRISPRi screening, Nature Methods, DOI: 10.1038/s41592-019-0629-y
https://www.nature.com/articles/s41592-019-0629-y

För mer information, kontakta:
Johan Elf, institutionen för cell- och molekylärbiologi vid Uppsala universitet, tel. 018-471 4678, 070-9803135 e-post: Johan.Elf@icm.uu.se